8-氧化咖啡因和嘧啶类生物碱在普洱熟茶中的存在

普洱茶是以云南大叶茶[ Camellia sinensis(Linn .) var. assamica (Masters ) Kitamura ] 为原料制作的茶类。普洱茶可分为普洱生茶(Pu-Er raw tea) , 普洱陈茶( Pu-Er aging tea ) 和普洱熟茶(Pu-Er ripe tea) 等三大系列(杨崇仁等, 2006 )。普洱生茶是未经过发酵生产的晒青毛茶, 既可作为绿茶饮用又可通过后发酵过程转化为普洱陈茶或普洱熟茶。普洱熟茶则是由普洱生茶经过微生物参与的后发酵过程生产得到的。
我们曾对普洱茶的化学成分进行研究, 从普洱生茶中分离到大量的酚类成分, 包括: ( + )儿茶素、( - ) 表儿茶素(EC)、(± ) 没食子儿茶素(GC)、( - ) 表没食子儿茶素( EGC)、( - ) 表儿茶素-3-O-没食子酸酯( ECG)、( - ) 表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯(EGCG) 、( - ) 表阿福豆素-3-O-没食子酸酯、槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄吡喃糖甙、芦丁、山奈酚、山奈酚-3-O-β-D-葡萄吡喃糖甙、山奈酚-3- O-芦丁糖甙、小木麻黄素( saictinin)、l , 6-O-二没食子酰基-β-D-葡萄吡喃糖、茶倍素、绿原酸、3α, 5α-二羟基-4-α-O-咖啡酰基金鸡纳酸、松柏醇甙、没食子酸; 以及咖啡因( 周志宏和杨崇仁, 2000)。
普洱熟茶的化学成分与普洱生茶有显著的差别, 我们曾报道金鸡纳素( cinchonain) 型的酚类化合物, 包括普洱茶素( puerin) A ( 1) 和B ( 2) ,以及epicatechin - [7, 8-bc ] -4α- (4-hydroxyl-phenyl ) -dihydro-2 (3H ) -pyranone (3 ) 和cinchonain Ib (4) ,为普洱熟茶的特征成分( 图1 )。其中, 化合物1和2 为新化合物, 3～4 系首次从茶科植物中分离得到。从普洱熟茶中我们还分离到( + ) -儿茶素(C)、( - ) 表儿茶素( EC) 、(± ) 没食子儿茶素(GC)、( - ) 表没食子儿茶素( EGC)、( - ) -表没食子酸葡萄糖甙、没食子酸、山奈酚、山奈酚-3-O-β-D-葡萄吡喃糖甙、山奈酚-3-O-芦丁糖甙、槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄吡喃糖甙、杨梅素(myricetin)、2 , 2′, 6 , 6′-四羟基二苯和2 ,5-二羟基苯甲酸等酚类化合物, 以及咖啡因(Zhou 等, 2005; 林智等, 2006) 。
为了进一步阐明普洱熟茶的物质基础, 系统的化学研究仍在深入进行中。本文在已有的工作基础上, 报道从云南省双江县产的普洱熟茶中新分离得到的生物碱和酚性化合物。

普洱熟茶成分


图1 普洱熟茶中的特征成分

1 实验部分
1 . 1 仪器与材料
1D, 2D-NMR 谱在氘代溶剂( CD3 COCD3 + D2O,CD3OD) 中用Bruker AM-400 和DRX-500 核磁共振仪测定, TMS 为内标, 化学位移δ用ppm (10 - 6 ) 表示, 偶合常数J 用Hz 表示。质谱在VG Auto Spec-3000 质谱仪上测定。柱层析用Diaion HP20SS (Mitsubishi Chemical Co .) ,MCI-gel CHP-20 ( 75 ～ 150 μm, Mitsubishi Chemical Co .) ,
Sephadex LH-20 (25～100 μm, Pharmacia Fine Chemical Co .Ltd .) , Chromatorex ODS ( 100 ～ 200 mesh , Fuji Silysia Chemical Co . Ltd .) 和硅胶H ( 青岛海洋化工厂) , 薄层层析用预制硅胶板H (0 . 20～ 0 . 25 mm, 青岛海洋化工厂) , 薄层层析展开剂为苯- 乙酸乙酯- 甲酸或氯仿-甲醇- 水, 显色剂为5%三氯化铁乙醇溶液或5%硫酸乙醇溶液, 加热显色。
普洱熟茶样品由云南省临沧市双江县双江勐库茶厂生产。
1 . 2 提取和分离
普洱熟茶( 10 kg ) 用60% 丙酮室温冷浸3 次, 过滤, 合并滤液, 减压回收丙酮后通过Sephadex LH-20 柱层析, 以MeOH-H2 O (1∶0～0∶1) 和50%丙酮梯度洗脱,得到11 个组分( Fr. 1-11 )。Fr .1 经MCI-gel CHP-20P,Sephadex LH-20 和Chromatorex ODS 等柱层析反复分离,MeOH-H2O 系统洗脱, 得到化合物5 (7mg) , 6 (10 mg) , 7(54 mg) 和8 (5 mg) 。Fr . 2 用MCI-gel CHP-20P 和SephadexLH-20 , Chromatorex ODS 等柱层析反复分离, 以MeOHH2O 梯度洗脱, 纯化得到化合物9 (2 mg) 和12 (15mg)。Fr . 8 用MCI-gel CHP-20P, Toyopearl HW-40F 和SephadexLH-20 柱层析反复分离, MeOH-H2O 洗脱, 得到10 ( 7mg)。同样, 从Fr . 10 部分得到化合物11 (11 mg)。
1 . 3 鉴定
胸腺嘧啶脱氧核苷( deoxythymidine ) (5) , 白色粉末,FAB- MS m/z 241 [M-H] - ; 1 H NMR ( 400 MHz,CDCl3 ) δ8 . 33 ( s, H - 6) , 1 . 85 ( s , H - 7) , 6 . 55 ( t , J = 6 . 9 , 6. 7 Hz,1′- H) , 2 . 60 (m, 2′- H) , 4 . 75 (m, 3′- H) , 4 .26 ( m, 4′-H) , 4 . 06 (dd , J = 11 . 8 , 3. 21 Hz, 5′- H) 和13 C MR ( 100MHz, CDCl3 ) δ12 . 1 (C - 7 ) , 39 .9 (C- 2′) , 71 .2 (C- 3′) ,85 . 8 (C- 1′) , 87 . 5 (C - 4′) , 111 . 0 (C- 5) , 137 . 5 (C - 6 ) ,151 . 5 (C- 2) , 165 . 5 (C- 4) 。(崔征等, 1995)
胸腺嘧啶( thymine ) (6) , 白色粉末, EI-MS m/z 126;1H NMR (400MHz, CDCl3 ) δ8. 46 ( s, H - 6) , 1. 76 ( s, H -7 ) 和13 C NMR (100MHz, CDCl3 ) δ153 .6 (C- 2) , 166 . 6 (C- 4) , 109 .0 (C- 5) , 138 . 9 (C- 6) , 12 .5 (C- 7)。
尿嘧啶( uracil ) (7 ) , 白色粉末, 负离子, FAB+ -MS m/z 113 [M+ H] + ; 1 H NMR (400MHz, CDCl3 ) δ5 . 42 (d ,J = 7 . 6 Hz, H - 5) , 7 . 36 (d , J = 7 . 6 Hz, H - 6) 和13 C NMR(100MHz, CDCl3 ) δ151 .5 (C- 2) , 164 . 4 (C- 4) , 110 . 0 (C- 5) , 142 .2 (C- 6)。
8-氧化咖啡因( 8-oxocaffeine ) ( 8 ) , 白色粉末, 负离子FAB- MS m/z 209 [M-H] - ; 1 H NMR ( 400MHz, CD3 Cl3 )δ3 . 17 ( s, NMe ) , 3 . 32 ( s, NMe ) , 3 .34 ( s , NMe ) 。13 CNMR ( 100 MHz, CDCl3 ) δ 28. 2 (Me ) , 28 . 6 ( Me ) , 31 .2(Me) , 100 . 1 (C - 4) , 148. 3 (C - 5) , 151 . 5 (C - 2) , 154 .7
(C- 6) , 162 . 0 (C- 8)。(Stadler and Fay, 1995)
黄杞甙( engeletin ) ( 9 ) , 黄色粉末, 负离子, FAB-MS m/z 431 [M-H] - ; 1H NMR ( 400 MHz, DMSO- d6 ) , δ6 . 27 ( br s , H - 6) , 6 . 46 ( br s, H - 8) , 6 .88 ( d , J = 8 .6Hz, H- 2′) , 7 . 78 ( d , J = 8 . 6 Hz, H - 3′) , 7 .78 ( d , J =8 . 6 Hz , H - 5′) , 6 . 88 ( d , J = 8 .6Hz, H- 6′) , 5 .01 ( d , rhaH- 6′) , 5 .01 ( d , rhaH - 1) , 1 .22 ( d , J = 6. 0 Hz, rha H - 6 )。(Krishnamachari等, 2002)
1 , 2 , 4-苯三酚( 1 , 2 , 4-benzenetriol ) ( 10 ) , 白色粉末, 负离子FAB- MS m/z 125 [M-H] - ; 1 H NMR ( 400MHz, CD3OD) : δ6 . 89 (H, br s, H- 3) , 7 . 07 (1H, d , J =8 . 2 Hz , H- 4) , 6 .05 (1H , d , J = 8 . 2 Hz, H - 6) 。
1 , 3-苯二酚(1 , 3-benzenediol ) ( 11) , 白色粉末, 负离子FAB- MS m/z 109 [ M-H ] - ; 1H NMR ( 400 MHz,CD3OD) , δ6 . 78 (2H , d , J = 8 .9 Hz , H- 2 , 4) , 8. 35 (1H,d , J = 8 .9 Hz, H - 3) , 7 . 35 (1H, br s, H - 6) 。
4-甲基-1 , 2-二苯酚( 4-methyl-1 , 2-benzenediol ) ( 12 ) ,白色粉末, 负离子FAB- MS m/z 124 [M-H] - ; 1 H NMR(400MHz, CD3OD) :δ7. 38 (1H, brs , H - 3) , 6. 84 (1H, d ,J = 8 .2 Hz, H - 5) , 7 .32 (1H, d , J = 8 . 2 Hz, H - 6 ) ; 13 CNMR (100MHz, CD3OD) : δ149 .6 ( s , C- 1) , δ144 . 5 ( s, C- 2) , 115 .5 ( d , C- 3) , 123. 9 ( s , C- 4) , 123. 4 ( d , C- 5) ,117 . 2 ( d , C- 6) , 50 . 2 ( q , C- 7) 。

2 结果与讨论
云南省双江县产的普洱熟茶的丙酮提取物,经Sephadex LH-20 , MCI-gel CHP-20P, ChromatorexODS, 和Toyopearl HW-40F 等柱层析反复分离,得到8 个化合物, 包括8-氧化咖啡因( 8-oxocaffeine) ( 8) (Stadler and Fay, 1995) , 以及嘧啶类生物碱: 胸腺嘧啶脱氧核苷( deoxythymidine ) ( 5 ) ,胸腺嘧啶( thymine ) ( 6) 和尿嘧啶( uracil ) (7 ) ,黄酮类配糖体: 黄杞甙( engeletin) (9 ) (Krish-namachari , 2002 ) , 以及简单酚类化合物: 1 , 2 , 4-苯三酚(1 , 2 , 4-benzenetriol ) ( 10)、1 , 3-苯二酚(1 , 3-benzenediol ) ( 11 ) 和4-甲基-1 , 2-二苯酚(4-methyl-1 , 2-benzenediol ) (12 ) ( 图2 )。这些化合物均为首次从普洱熟茶中分离得到。

化合物5～12

图2 从云南省双江县产普洱熟茶中分离得到化合物5～12

已知茶叶中富含嘌呤类生物碱类化合物,如: 咖啡因、可可碱、茶碱、黄嘌呤、乌便嘌呤等。已报道8-氧化咖啡因( 8 ) 为咖啡在炒制、磨碎和速溶等加工过程中由咖啡因氧化形成的,是加工咖啡的标志性成分, 具有显著的抗氧化活性, 至今尚未从茶叶中分离到。我们从普洱熟茶中首次分离到8-氧化咖啡因(8 ) , 显然是普洱茶在高温高湿的后发酵过程中, 在微生物的作用下经生物转化形成的产物, 对于普洱熟茶的品质和生理活性评价有着重要的意义。
嘧啶类生物碱( 如: 尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶等) 亦存在于茶叶等高等植物中。而核苷和脱氧核苷则是微生物和动物生殖细胞的构成成分, 极少在植物中发现。该类化合物参与DNA 代谢过程, 是DNA 和RNA 的组成, 具有显著的生理活性(Kinahan 等, 1981)。胸腺嘧啶脱氧核苷( 5) 主要存在于海洋生物中, 也有报道从贝母和竹叶菜( Smilacina atropurpurea ) 中分离得到( 崔征等, 1995; 饶志刚等, 1997; 严忠红等, 1999; 杨顺利和刘锡葵, 2003 ) , 是抗AIDS 病药物Stavudine and Zidovudine (AZT) 合成的中间体。我们从普洱熟茶中首次分离到胸腺嘧啶脱氧核苷( 5) , 有可能是茶叶中的嘧啶类生物碱与微生物中的核苷类化合物在后发酵过程中缩合形成的。