苦茶camelliaassamicavar.kuchachangetwang的嘌呤生物碱

叶创兴林永成苏建业宋晓虹张宏达

摘要：用重量法和柱层析法从苦茶camelliaassamicavar.kuchachangetwang的嫩梢中分离出3种嘌呤生物碱，经薄层层析、熔点测定、元素分析、核磁共振和质谱等对其结构的测定，鉴定为咖啡碱、1，3，7，9-四甲基尿酸和可可碱，其百分含量分别为0.88%，0.84%和0.29%.样品水提物经氯仿萃取后直接由高压液相色谱分析，测得苦茶含咖啡碱1.9329%，四甲基尿酸1.2941%，可可碱0.5855%，茶叶碱0.0128%.这是茶组植物中嘌呤生物碱新的分布模式.

关键词：苦茶camelliaassamicavar.kuchachangetwang；嘌呤生物碱；1，3，7，9-四甲基尿酸；咖啡碱

中图分类号：q946.88文献标识码：a

purinealkaloidsincamelliaassamicavar.kuchachangetwang

yechuang-xing*,linyong-cheng,sujian-ye,songxiao-hong,zhanghong-da

*schooloflifesciences,zhongshanuniversity,guangzhou510275,china

abstract：purinealkaloidsincamelliaassamicavar.kuchachangetwangwereinvestigatedbyextractioncombinedwithsilicagelcolumnchromatography.threeproductswereisolated.productaandcweredeterminedascaffeineandtheobrominebytlcandmeltingpointcomparedwithstandards.thestructureofproductbweredeterminedbymsand1hnmr,theelementanalysisandmeltingpointfor1,3,7,9-tetramethyluricacid.thepurinealkaoidswereconsistedofcaffeine,1,3,7,9-tetramethyluricacid,theobromineandtheophyllineintheleavesofc.assamicavar.kucha,andtheircontentwas1.9329%,1.2941%,0.5855%and0.0128%respectivelybyhplc.thedistributionofnewtypeofpurinealkaloidsandsuchhighcontentoftetramethyluricacidinwildteatreeresourcesisfirstlyreported.

keywords：camelliaassamicavar.kucha;dominantpruinealkaloid;1,3,7,9-tetramethyluricacid;caffeine

山茶属camellia约280种，其中茶组camelliasect.theal.有32种，著名的饮料茶叶就是来自茶组植物的茶c.sinensis(l.)o.ktze和普洱茶c.assamica(mast.)chang.茶叶含有复杂的化学成分，其中嘌呤生物碱是茶最重要的化学成份之一，其他的化学成份尚有茶氨酸、儿茶素、芳香油、色素、糖类、有机酸、维生素类、酶类、水浸出物和矿质元素等.在茶叶商品流通中，把咖啡碱、锰、儿茶素和茶氨酸列为辨别真假茶必检的项目.可见咖啡碱在茶叶中生化成份检测中的地位［1］.茶叶的生物碱主要为嘌呤碱，也有少量的嘧啶碱.在茶叶中发现的嘌呤碱有咖啡碱、可可碱、茶叶碱、腺嘌呤、鸟便嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤和拟黄嘌呤等.其结构特点系以嘌呤环为基本骨架，不同种类的嘌呤碱取决于嘌呤环上甲基的位置和个数.茶叶生物碱中，咖啡碱占干质量2%～4%，可可碱约0.05%，茶叶碱约0.002%.目前在茶组植物中，已经发现了和茶不同的嘌呤碱分布模式，这就是以可可碱为主要成份的缅甸茶c.irrawadiensisbarua、紫果茶c.purpureachangetchen和可可茶c.ptilophyllaching［2］的芽叶含可可碱为主，其中可可茶含可可碱超过干质量的4%，最高达6.84%［3～7］.最近在chinatea研究苦茶c.assamicavar.kuchachangetwang时，分离出具有意义的较高含量的1，3，7，9-四甲基尿酸.下面是研究的初步结果.

1样品和试剂、仪器

1.1供试样品

采摘1芽2叶苦茶鲜样，经隔水蒸15min，在80℃烘箱中烘干，置于放有硅胶的干燥器中备用.栽于中山大学实验园地的苦茶是1986年由采自原产地的种子实生苗成长的，树高2m左右.

1.2试剂

醋酸铅、氯仿、乙酸乙酯，标准品：咖啡碱、茶叶碱、可可碱，均为分析纯以上，咖啡碱和可可碱购自上海，茶叶碱购自美国sigma公司.

薄层析硅胶gf254，颗粒活度160～200；柱层析拌样用硅胶300目，装柱用硅胶60-100目，均购自青岛.

1.3仪器

显微镜熔点仪，500mhz核磁共振仪，zab-hs质谱仪，240型元素分析仪，sp8800高压液相色谱仪.

2实验部分

2.1苦茶嘌呤生物碱的分离和鉴定

(1)准确称取5g(精确到0.01g)苦茶样品，加入500ml水，加热浸提30min，过滤后，滤渣再用500ml水加热浸提30min，合并2次的滤液.在滤液中加入醋酸铅溶液，出现絮状沉淀，一直到滤液不再出现沉淀为止(约需醋酸铅2g).过滤后将滤液浓缩至80ml，并用少量沸水洗涤滤渣.滤液经冷却后过滤，滤出的固体为产品c，蒸干得0.29%.滤液再在分液漏斗中用15ml氯仿×3萃取，水相用tlc检测，与标准品对照未发现茶叶碱.将萃取液合并，氯仿蒸干后，得到灰白色的固体.将固体溶于氯仿，用300目以上的细硅胶拌样，用60～100目的粗硅胶装柱层析，以乙酸乙酯作洗脱剂.分离得2个纯的产品a和b，其含量分别占干质量0.88%和0.84%.θmpa为238℃，b为226～228℃，c为357℃.

(2)荧光硅胶薄层层析：以乙酸乙酯为展开剂，咖啡碱、可可碱和茶叶碱标准品与a、b、c对照，表明a是咖啡碱，c是可可碱，b是嘌呤碱，它们的rf分别为0.31、0.48和0.38.

(3)产品b核磁共振:δ(500ft，cdcl3，tms)为3.39(s，3h)，3.59(s，3h)，3.64(s，3h)，3.74(s，3h).

(4)产品b的质谱:m/e(fab)为225(m++1)，209，194，180，167，139.

(5)产品b元素分析(c9h12n4o3，w/%，括号里为计算值)：c0.481(0.482)，h0.052(0.054)，n0.243(0.250).结合熔点测定与文献报道一致，可确定产品b为1，3，7，9-四甲基尿酸.

2.2应用高压液相色谱对苦茶的分析

(1)内标溶液：称取愈甘醚，溶解成2.5mg/ml溶液.

(2)标准溶液配制及分析：称取一定量的标准品咖啡碱、茶叶碱、可可碱以及由2.1分离提纯的1，3，7，9-四甲基尿酸，加入10ml内标溶液，100ml沸水，并保温30min.取完全溶解的混合液10ml，加入20ml的氯仿萃取，静止分层后取氯仿溶液进样，依据标准品的含量与峰面积加以对照.

(3)试样处理：将干燥的茶样磨碎后准确称取1g，加内标溶液10ml，加沸水90ml，在水浴中保温1h，趁热过滤，取滤液10ml，加20ml氯仿萃取，取氯仿液进样.

(4)流动相为v(甲醇)∶v(磷酸缓冲液(ph=6))=70∶30.流动速度为1ml/min.

(5)分析结果：经与标准品比较，苦茶样品质量分数平均值(±sd)/%,n=4：咖啡碱1.9329±0.12，1，3，7，9-四甲基尿酸为1.2941±0.11，可可碱0.5855±0.11，茶叶碱0.0128±0.001.图1是茶样和标准化合物的高压液相色谱谱图.

图1苦茶样嘌呤碱高压液相分离色谱图

fig.1hplcchromatography

3讨论

(1)用2次较大量的水浸提，苦茶嘌呤生物碱绝大部分已经溶解在沸水中，滤液浓缩到80ml，因可可碱在冷热水中的溶解度显著不同，经冷却析出的固体为可可碱.茶叶碱